Izolacija fruktoze i inulina iz korijena maslačka
(TARAXACUM OFFICINALE WEB.)

Maslačak(Taraxacum officinale Web.) je trajna, vrlo raširena biljka čiji se oblik uvelike mijenja prema staništu i ekološkim uvjetima. Raste na svim kontinentima i nadmorskim visinama [1,2]. Iako se maslačak često smatra korovom, radi se zapravo o korisnoj i ljekovitoj biljci. Njegovu ljekovitost prvi je opisao Hieronymus Bock [3]. Korijen maslačka upotrebljava se za liječenje raznih bolesti kao što su reuma, giht, šećerna bolest, bolesti jetre, bubrega i slezene, jer dobro utječe na vezivno tkivo koje je zbog njegova djelovanja bolje prokrvljeno, a spriječava i nastanak žučnih kamenaca [2]. Upotrebljava se u narodnoj medicini kao laksativ, tonik i diuretik zbog prisustva kalija [4]. Cvjetni pupoljci maslačka kisele se u octu, služe kao začin ili za pripremu meda. Mladi listovi koriste se kao proljetna salata još od 17. st., a u novije vrijeme maslačak se počeo i uzgajati. Kulturom je dobiveno nekoliko oblika s velikim listovima. Maslačak cvate od ožujka do svibnja [2]. Listovi se beru u proljeće, u travnju i svibnju, a korijen u jesen jer tada sadrži najviše inulina [5].

Tablica 1: Sadržaj korijena maslačkaa,b

Sastojci Masa, g/kg Sastojci Masa, g/kg Sastojci Masa, g/kg inulin 400 saharoza 11 fosfor 3,6 bjelančevine 165 kalcij 6,1 magnezij 2,5 pektin 78 natrij 5,2 vitamin C 0,4 kalij 75 glukoza 5,0 b-karoten 0,1 masti 16

a također su nađeni u manjim količinama: tanini, eterična ulja, kolin, levulin i gorki heterozidi (taraksacin i taraksacerin);
b navedene vrijednosti su maksimalne

Maslačak je, uz cikoriju, karakterističan predstavnik porodice glavočika kod kojih su rezervni šećeri fruktani. Fruktani spadaju u skupinu nestrukturnih energetskih ugljikohidrata [6]. Prvi ih je opisao njemački znanstvenik Rose (1804.), a Thomson ih je 1818. godine nazvao inulinom. Osnovna je struktura fruktana molekula glukoze povezana s mnogo molekula fruktoze (do 200). Fruktane dijelimo na tri skupine: inulini, levani i fruktani mješovitog tipa, a razlikuju se međusobno po glikozidnim vezama među molekulama fruktoze. Nama najzanimljivija skupina su inulini. To su linearni fruktani kod kojih su molekule fruktoze povezane b(2 -> 1) glikozidnom vezom. Najkraći fruktan inulinskog tipa je 1-kestoza u kojoj je molekula glukoze povezana s dvije molekule fruktoze (Slika 1).

Slika 1: Struktura 1-kestoze

Tijekom rada korišten je pribor: kuhinjski nož, sušionik, ribež, porculanska posuda, Erlenmeyerova tikvica, gumeni čep, odmjerna tikvica, čaša, lijevak, naborani filter papir, mikrovalna peć (snaga 1100 W), sinter lijevak, vodena kupelj, plamenik, univerzalni indikator papir (Merck), hladnjak.

Upotrijebljene su sljedeće kemikalije: jodna voda (0,1 g joda u 10 cm3 70% etanola); klorovodična kiselina, HCl (c = 1 mol/dm3 i konc.); natrijev hidroksid, NaOH (c = 2 mol/dm3); aktivni ugljen; etanol, C2H5OH (apsolutni, 96% i 70%); natrijev karbonat, Na2CO3 (c = 1,6x10-6 mol/dm3, pH = 8.5); vodikov peroksid, H2O2 (w = 28-32%); rezorcinol (1,3-benzendiol), C6H4O2; fruktoza, C6H12O6.

Cilj rada

U okviru ovog rada biti će diskutirana izolacija saharida iz korijena maslačka. Korijen maslačka je bran u jesen, jer tada sadrži najviše inulina (čak do 40 %), [5]. Hidrolizom s klorovodičnom kiselinom i mikrovalnim zagrijavanjem biti će provedena izolacija inulina u obliku monomera fruktoze. Također će biti opisana izolacija inulina hidrolizom s natrijevim karbonatom.

Sakupljanje korijena maslačka

Ubrano je petnaestak korijena maslačka zajedno s lisnom rozetom, jer se odvajanjem rozete od svježeg korijena gubi inulin kojeg najviše ima u vrhu korijena, pri lisnoj rozeti. Za kvalitetniju izolaciju fruktoze i inulina važno je pažljivo posušiti korijenje maslačka, koje je zajedno s lisnom rozetom sušeno tjedan dana u prozračnoj prostoriji i još četiri dana u sušioniku na temperaturi od 45 °C [2]. Lisna rozeta je odrezana (Slika 2). Presjek korijenja maslačka ovlažen je jodnom vodom pri čemu nije poplavio, što je dokaz da maslačak ne sadrži glukozu u obliku škroba [5]. Korijenje je naribano u porculansku posudu. Dobiveno je 25 g osušenog i usitnjenog korijenja maslačka, uzorak 1 (Slika 3).

Slika 2: Ubrano korijenje maslačka	Slika 3: Osušeno i usitnjeno korijenje maslačka, uzorak 1

Izolacija fruktoze kiselom hidrolizom

U Erlenmeyerovu tikvicu stavljeno je 8 g uzorka 1 i zakiseljeno s 20 cm3 klorovodične kiseline (c = 1 mol/dm3). Tikvica je začepljena gumenim čepom. Hidroliza je trajala tjedan dana pri temperaturi 37-40 °C u termostatiranom sušioniku. Nakon toga, je sadržaj tikvice neutraliziran dodavanjem otopine natrijeva hidroksida (c = 2 mol/dm3), te mu je dodano 20 cm3 destilirane vode. Da je otopina neutralizirana, potvrđeno je univerzalnim indikator papirom. Uzorak je profiltriran preko naboranog filter papira da bi se uklonili ostaci staničevine, a filtrat mikrovalno zagrijavan 1 minutu u kuhinjskoj mikrovalnoj pećnici. Filtrat je bio mirisa meda i izrazito žute boje. Nakon toga uzorak je profiltriran preko sinter lijevka i pročišćen nekoliko puta aktivnim ugljenom, uz zagrijavanje na vodenoj kupelji pri temperaturi 95 °C (Slika 4). Aktivni ugljen odvojen je filtracijom, a filtrat je pažljivo uparen na vodenoj kupelji do suhoga tako da fruktoza ne karbonizira. Prekristalizacija je izvedena najprije iz apsolutnog, a potom iz 96% etanola. Dobiveni su smeđi higroskopni kristalići izoliranog materijala 2 (Slika 5), m = 1,57 g, (19,6%).

Slika 4: Pročišćavanje aktivnim ugljenom	5: Izolirani materijal 2

Izolacija inulina u baznom mediju

U Erlenmeyerovu tikvicu stavljeno je 6,2 g uzorka 1 te zaluženo sa 100 cm3 otopine natrijeva karbonata, (c = 1,6x10-6 mol/dm3, pH = 8.5). Izluživanje je trajalo 1 sat pri temperaturi od 60 °C u termostatiranom sušioniku. Nakon izluživanja, sadržaj tikvice filtriran je preko naboranog filter papira da se uklone mehaničke nečistoće. Filtrat je bio izrazito smeđe boje. Uzorku, ohlađenom na 20 °C, dodaje se 50 cm3 vodikova peroksida (w = 28-32%). Dolazi do intenzivnog pjenjenja tijekom 2,5 sata zbog relativno visokog udjela proteina (36-165 g/kg). Vodikov peroksid oksidira nečistoće ekstrahirane iz korijena maslačka zajedno s inulinom, ali ne može oksidirati hidroksilne skupine inulina [7]. Filtrat nakon dodatka vodikova peroksida mijenja boju do bistro žute. Nakon prestanka pjenjenja, reakcijska smjesa spremljena je u hladnjak na temperaturu od 4 °C pri čemu su dobiveni kristali 3.

Analiza izoliranog materijala

Prisustvo ketoza (fruktoze) može se dokazati Seliffanovljevim reagensom, koji se dobiva otapanjem rezorcinola (1,3-benzendiola) u razrijeđenoj klorovodičnoj kiselini. Prilikom dodatka ovog reagesa otopini ketoze klorovodična kiselina oduzima tri molekule vode, pri čemu nastaje derivat furfurala koji s rezorcinolom stvara kondenzacijski produkt crvene boje, (Shema 1).

Shema 1

Seliffanovljev reagens pripremljen je otapanjem 1 g rezorcinola u destiliranoj vodi kojoj je dodano 33 cm3 konc. klorovodične kiseline, te je razrijeđena do 100 cm3 u odmjernoj tikvici [8]. Vodena otopina izoliranog materijala 2 dodatkom Seliffanovljevog reagensa daje crveno obojenje, a isti rezultat je dobiven dodatkom reagensa u vodenu otopinu izoliranog materijala 3. Kao slijepa proba, reagens je dodan u otopinu fruktoze (p.a.) koja se također obojila u crveno.

Ubran je korijen maslačka u jesen, kada sadrži do 40% inulina, te je sušen i usitnjen. Njegovom kiselom hidrolizom (HCl, c = 0,1 mol/dm3) te prekristalizacijom iz etanola izoliran je materijal 2, a izlučiavnjem (Na2CO3, c = 1,6x10-6 mol/dm3, pH = 8.5) je dobiven materijal 3. Analiza Seliffanovljevim reagensom je pokazala da uzorci 2 i 3 sadrže ketoze.

1. Nikolić (ur.),
   Liječnik u kući,
   Stvarnost, Zagreb, 1971, str. 467-468
2. Lj. Grlić,
   Enciklopedija samoniklog jestivog bilja,
   August Cesarec, Zagreb, 1986, str. 325-327
3. R. Willfort,
   Ljekovito bilje i njegova upotreba,
   Mladost, Zagreb, 1989, str. 371-372
4. http://www.mc.vanderbilt.edu/vumcdept/derm/contact/TA001.html
5. J. Tucakov,
   Lečenje biljem,
   Rad, Beograd, 1986, str. 469-471
6. http://www.geocities.com/CapeCanaveral/4409/fructan.htm
7. Cristianio Pedersini, Polytech S.c.a.r.l. Area Science Park, Padriciano 99, 34012 Trieste, Italy
   (diskusijska lista za prirodne spojeve na Internetu: napronet@bilkent.edu.tr)
8. A. Kučak,
   Vježbe iz organske kemije i biokemije,
   Interna skripta, Rudarska i kemijska škola, Varaždin, 1996
9. http://hpd.botanic.hr/kem



Zahvala

E-školi mladih znanstvenika (9) na financijskoj potpori te
dr. sc. Cristianu Pedersiniju, Politech (Trst),
recenzentici mr. sc. Ivanki Jerić, Institut "Ruđer Bošković"; (Zagreb) i
lektorici prof. Vesni Marković, Rudarska i kemijska škola (Varaždin) na savjetima i diskusijama.